جمع آوری نمونه جهت تشخیص بیماری زبان آبی

به گزارش «سرویس دام، طیور و آبزیان» «ماکی دام - پایگاه خبری صنعت دام، طیور، آبزیان و حیوانات خانگی»؛ در مورد ویروس زبان آبی انجماد بافت‌های آلوده موجب ازبین رفتن ویروس می‌شود.

نمونه‌های بافت شناسی: زخم‌های محوطه دهانی و زخم‌های مخاطی پوستی، شیردان، شریان ششی، عضلات ماهیچه‌های اسکلتی از بخش‌های مختلف و عضلات پرزی بطن چپ که تمام بافت‌های مذکور در محلول مناسب ثابت شده‌اند. مغز جنین سقط شده (جهت مشاهده با میکروسکوپ نوری و ایمونوهیستوشیمی).

نمونه‌های ویروس‌شناسی: ریه و طحال به‌صورت خنک شده. بافت‌های سیستم اعصاب مرکزی و مایعات قفسه سینه جنین سقط شده (جهت انجام آزمایش‌های ISO, PCR, in situ HYBRID, ELISA,…)

در صورتی‌که بخواهیم نمونه‌ها را برای مدت طولانی نگهداری کنید در حالی که امکان منجمد کردن آن‌ها وجود ندارد، نمونه‌های خون باید در ظروف حاوی اکسالات - فنول -گلیسیرین نگهداری شوند.

اگر امکان منجمد کردن نمونه‌ها وجود داشته باشد، باید آن‌ها را در بافر لاکتوز پپتون یا یا دی متیل سولفواکساید 10% در دمای 70- درجه سانتی‌گراد یا سردتر نگهداری نمود. باید توجه نمود که ویروس نمی‌تواند در دمای 20- درجه سانتی‌گراد خیلی دوام پیدا کند.

اندام‌ها و بافت‌ها بایستی در دمای 4 درجه سانتی‌گراد به آزمایشگاه ارسال شوند.

علاوه براین از نمونه‌های خون و سرم نیز جهت تشخیص این بیماری استفاده می‌شود.

طبق پروتکل سازمان دامپزشکی کشور در سال 1391، در فصول پرخطر ازنظر انتقال عفونت، پس از بارندگی و درجه حرارت مناسب جهت ردیابی و پایش می‌توان از هر گله مشکوک 15 نمونه سرم و 15 نمونه خون EDTA به‌صورت تصادفی تهیه و برای انجام آزمایش الیزای رقابتی و PCR به آزمایشگاه فرستاد تا وضعیت بیماری مورد بررسی قرار گیرد.

از روش‌های تشخیصی مشابهی برای دام‌های اهلی و وحشی استفاده می‌شود. سیستم‌های جداسازی متعددی برای BTV به‌طور معمول استفاده می‌شود، اما حساس‌ترین روش تلقیح در تخم‌مرغ جنین‌دار است (ECE).

اگر عیار ویروس در نمونه‌های خون پایین باشد (برای مثال در مواردی که نمونه‌ها چند هفته پس از آلودگی تهیه می‌شوند)، تلقیح به گوسفند یک روش مفید می‌باشد. تلاش برای جداسازی ویروس در کشت‌های سلولی in vitro آسان است، اما میزان موفقیت در مقایسه با روش‌های in vivo پایین‌تر است.

EHDV نیز ممکن است در سیستم‌های جداسازی مشابه BTV جداسازی شود، اما تلقیح اولیه کشت‌های سلولی مانند سلول‌های C6/36 نیاز به پاساژ اولیه در ECE را ازبین برده و حساسیت خود را حفظ می‌کند.

جداسازی در تخم‌مرغ جنین‌دار

i) خون از دام‌هایی که تب دارند جمع‌آوری شده و در داخل ظروفی که حاوی EDTA (اتیل آمین دی آمین تترا استیک اسید)، هپارین یا سدیم سیترات است، ریخته می‌شود.

سلول‌های خونی سه مرتبه با بافر فسفات سالین (PBS) سترون شسته می‌شوند. سلول‌های شسته شده مجدداً به PBS یا سدیم کلرید ایزوتونیک تعلیق می‌شوند و سپس در دمای 4 درجه سانتی‌گراد ذخیره شده یا بلافاصله برای جداسازی مورد استفاده قرار می‌گیرند.

ii) اگر نگهداری نمونه‌ها برای مدت طولانی در یخچال ممکن نباشد، نمونه‌های خون در گلیسرین فنول اکسالات جمع‌آوری می‌شوند. اگر بتوان نمونه‌ها را منجمد کرد، باید آن‌ها را در بافر پپتون لاکتوز یا متیل سولفوکساید%10  جمع‌آوری و آن‌ها را در دمای 70 - یا سردتر ذخیره نمود. ویروس در دمای 20- نمی‌تواند برای مدت طولانی باقی بماند.

iii) در مواردی که بیماری کشنده است، برای جداسازی ویروس ترجیحاً از طحال و گره‌های لمفاوی استفاده می‌شود. اندام‌ها و بافت‌ها باید در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری و به آزمایشگاه منتقل شوند.

در آزمایشگاه نمونه‌ها در PBS یا سالین ایزوتونیک همگن می‌شوند و به روشی که در زیر توضیح داده می‌شود برای سلول‌های  خونی استفاده می‌شوند.

iv) سلول‌های خونی شسته شده مجدداً در آب مقط تعلیق می‌شوند یا در PBS سونیکه می‌شوند. به مقدار 0/1 میلی‌لیتر به‌صورت داخل رگی به تخم‌مرغ جنین‌دار (ECE) 15-9 روزه تلقیح می‌شود.

v) تخم‌مرغ‌ها در اتاقک‌های مرطوب با دمای 33/5-32 درجه سانتی‌گراد گرم‌خانه گذاری و هر روز کندل می‌شوند. مرگ جنین‌ها در 24 ساعت اول پس از تلقیح به‌عنوان موارد غیر اختصاصی درنظر گرفته می‌شوند.

vi) جنین‌هایی که بین روز‌های 2 و 7 تلف می‌شوند، در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری می‌شوند. جنین‌هایی که تا 7 روز زنده می‌مانند، باید کشته شوند.

ممکن است جنین‌های مرده و جنین‌هایی که تا روز هفتم زنده می‌مانند، همگن کرده و در دو ظرف جداگانه قرار داده می‌شوند. جنین‌های کامل، پس از جدا نمودن سر و اندام‌هایی مانند کبد، طحال، قلب، ریه و کلیه همگن و سانتریفوژ می‌شوند.

vii) می‌توان ویروس را به‌طور مستقیم با antigen capture ELISA یا RT-PCR، یا به‌طور غیرمستقیم با روش‌های شناسایی آنتی‌ژن مانند ایمونوفلئورسنس یا ایمونوپراکسیداز پس از تقویت در محیط‌های کشت شناسایی نمود.

viii) اگر هیچ‌یک از جنین‌ها پس از تلقیح ویروس کشته نشدند باید تلقیحی که از پاساژ مواد در تخم‌مرغ به‌دست آمده است، مجدداً در ECE یا کشت سلول پاساژ داده شود.

جداسازی در کشت سلول

جداسازی ویروس می‌تواند در کشت‌های سلولی مناسب مانند mous L، BHK -21، Vero یا Aedes  albopictus clone C6/36 (AA) انجام پذیرد.

تأثیر جداسازی در سلول‌های کشت داده شده به میزان قابل‌توجهی نسبت به ECE پایین‌تر است. میزان بازیافت در جداسازی اولیه ویروس در ECE و به دنبال آن پاساژ دادن در سلول‌های C6/36 (AA) جهت تکثیر، بالا است.

علاوه براین پاساژ معمولاً برای رده‌های سلولی جانوری مانند BHK -21 یا Vero صورت می‌گیرد. در سلول‌های AA ضرورتاً اثرات سیتوپاتیک (CPE) مشاهده نمی‌شود، در حالی که سلول‌های تک‌لایه برای ظهور CPE به‌مدت 5 روز در دمای 37 درجه سانتی‌گراد، با CO2 5%  و در شرایط مرطوب بررسی می‌شوند.

اگر هیچ CPE ظاهر نشود یک پاساژ ثانویه در کشت سلول صورت می‌گیرد. تأیید تشخیص BTV در محیط کشت سلول‌هایی که دارای CPE هستند با برخی از روش‌های ایمنی‌شناسی مانند antigen capture ELISA، ایمونوفلئورسنس، ایمونوپراکسیداز، آزمون خنثی‌سازی ویروس یا RT-PCR صورت می‌گیرد.

جداسازی در گوسفند

i) گوسفند با استفاده از سلول‌های شسته شده از 500-10 میلی‌لیتر خون یا 50-10 میلی‌لیتر سوسپانسیون بافت تلقیح می‌شود. مواد تلقیح به‌صورت زیرجلدی در 20-10 میلی‌لیتر مایع تلقیح می‌شود.

حجم‌های بالا به  جداسازی ویروس کمک می‌کند اما باید تلقیح به صورت داخل وریدی انجام شود.

ii) گوسفند‌ها برای 28 روز نگهداری شده و روزانه از جهت داشتن تب و ضعف ناشی از پاسخ آنتی‌بادی با استفاده از آزمون‌های سرم‌شناسی مانند C-ELISA بررسی می‌شوند. معمولاً 7 تا 14 روز پس از تلقیح، خون گوسفند حاوی ویروس جدا شده است که می‌توان آن را به صورت زنده در دمای 4 یا 70 - درجه سانتی‌گراد ذخیره نمود.