به گزارش «سرویس دام، طیور و آبزیان» «ماکی دام - پایگاه خبری صنعت دام، طیور و آبزیان»؛ در این بخش به نحوه‌ی شناسایی گونه‌های مختلف کمپیلوباکتر در آزمایشگاه تشخیصی می‌پردازیم.
1) ساختار کلونی
کلونی‌های کمپیلوباکتر فتوس معمولاً بعد از 5-2 روز در محیط کشت ظاهر می‌شوند. برای جلوگیری از رشد کلونی‌های اختصاصی توسط آلاینده‌ها، توصیه می‌شود که محیط را هر روز ارزیابی و کلونی‌های مشکوک را ساب کالچر کنید. بعد از 5-3 روز گرم‌خانه گذاری، اندازه کلونی‌ها به 1 میلی‌متر می‌رسد.
این کلونی‌ها به رنگ خاکستری و صورتی کم‌رنگ، گرد، محدب، صاف و درخشان با حاشیه منظم مشاهده می‌شوند.
2) ساختار ماکروسکوپیک
کمپیلوباکترها محرک هستند و در طی ساب کالچر ممکن است ناپدید شوند. این باکتری اغلب به صورت اجرام باریک، باسیل خمیده و با عرض 0/4-0/3 میکرومتر و طول 8-0/5 میکرومتر مشاهده می‌شود.
ممکن است به‌طور هم‌زمان در حالت زنده، کمپیلوباکتر به سه اندازه کوتاه (شبیه ویرگول)، متوسط (شبیه S) و طویل (به شکل مارپیچی) وجود داشته باشد.
3) آزمون‌های بیوشیمیایی (جدول 7)
4) اتمسفر: کمپیلوباکتر در شرایط هوازی رشد نمی‌کند.
تشخیص بیوشیمیایی تحت گونه‌های کمپیلوباکتر فتوس
آزمون‌هایی که در جدول 7 توضیح داده شده است باید بر روی کشت خالص انجام پذیرد.
جدول شماره 7: ویژگی‌های متفاوت گونه‌های کمپیلوباکتر که از دستگاه تناسلی گاو و جنین سقط شده
جدا شده است. |
نالیدیکسیک
اسید |
H2S(b) |
گلایسین
% 1 |
Nacl
3.5% |
کاتالاز |
اکسیداز |
42°c |
15°c |
|
|
V |
- |
- |
- |
V |
+ |
- |
V |
c.fetus
subsp.venerealis |
|
R |
- |
+ |
- |
+ |
+ |
V(a) |
+ |
c.fetus
subsp.fetus |
|
S(e) |
- |
V |
- |
V(d) |
+ |
V© |
- |
c. jejuni |
|
R |
V |
V |
- |
+ |
+ |
+ |
- |
c.hyointestinalis |
|
V |
+ |
+ |
+ |
V |
+ |
+ |
- |
c.sputorum |
(a): اگرچه کمپیلوباکتر فتوس متعلق به کمپیلوباکتر‌های ترموفیلیک نیست، اما تعداد
قابل توجهی از سویه‌های این گونه در دمای 42 درجه سانتی‌گراد رشد می‌کنند
(b): در محیط triple sugar iron agar
(c): c.jejuni subsp.jejuni مثبت و c.jejuni subsp.doylei منفی
(d): c.jejuni subsp.jejuni مثبت و c.jejuni ubsp.doylei گاهی مثبت و گاهی منفی
(e): طبق سویه‌های Bergeg’s Manual حساس هستند، با این حال سویه‌های مقاوم
به‌طور متناوب گزارش شده‌اند.
(+): واکنش مثبت یا رشد.
(-): واکنش منفی یا عدم رشد سویه‌ها در محیط مناسب و تحت شرایط خاص
(V): نتایج متفاوت
(S): حساسیت
(R): مقاومت |
1) رشد در دمای 25 و 42 درجه سانتی‌گراد:
یک سلول مشکوک به دو محیط پلیت با پایه خون تلقیح می‌شود. هر پلیت در اتمسفر خاص و در دمای 25 و 42 درجه سانتی‌گراد گرم‌خانه گذاری می‌شود. سویه‌های کنترل هم زمان مورد آزمایش قرار می‌گیرند.
2) اکسیداز و کاتالاز:
آزمون‌ها بر طبق پروتکل باکتری شناسی استاندارد انجام می‌شوند. سویه‌های کنترل هم‌زمان
مورد آزمایش قرار می‌گیرند.
3) رشد در حضور سدیم کلرید:
یک سلول مشکوک به محیط بلاد حاوی 3/5 درصد (Nacl15 میلی‌لیتر محیط بلاد+ 2/04 میلی‌لیتر محلول سدیم کلرید 5 مولار) و محیط plain blood تلقیح می‌شود.
گرم‌خانه گذاری تحت اتمسفر خاص صورت می‌گیرد. سویه‌های کنترل هم زمان مورد آزمایش قرار می‌گیرند.
4) رشد در حضور گلایسین 1%:
یک سلول مشکوک به محیط گلایسین (15 میلی‌لیتر محیط با پایه خون+ 1/65 میلی‌لیتر محلول آبی 10 % از گلایسین سترون فیلتر شده) و روی همان محیط بدون گلایسین تلقیح می‌شود.
گرم‌خانه گذاری تحت اتمسفر خاص صورت می‌گیرد. سویه‌های کنترل (از تحت گونه‌های ونرالیس و فتوس) هم‌زمان مورد آزمایش قرار می‌گیرند. از آنجایی که تمام سویه‌ها سخت رشد هستند، تغییرات اندک در محیط می‌تواند مهم باشد. درصورت عدم رشد در حضور گلایسین، باید به آزمون احتمالی برای کمپیلوباکترفتوس تحت گونه ونرالیس توجه نمود.
5) تولید هیدروژن سولفید در محیط TSI:
این آزمون بر روی محیط TSI تحت شرایط ویژه‌ای انجام می‌شود.
محیط حاوی پپتون (g/litre 20)، عصاره گوشت (g/litre 2/5)، عصاره مخمر (g/litre 3)، سدیم کلرید (g/litre 5)، فریک سیترات (g/litre 0/5)، سدیم تیوسولفات (Na2S2O3) (g/litre 0/5) و آب مقطر (تا 1 لیتر) می‌باشد.
سپس این محیط داخل لوله‌ها توزیع می‌شود و در اتوکلاو با دمای 115 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 دقیقه قرار داده می‌شود. سپس به حالت مورب گذاشته شده تا به حالت جامد تبدیل شود.
6) تولید هیدروژن سولفید در محیط سیستئین:
آزمون H2S در محیط براث بروسلا که حاوی 0/02 درصد سیستئین است صورت می‌گیرد. تولید H2Sبا نوار سرب استات که به قسمت داخلی بالای لوله متصل شده است، شناسایی می‌شود.
یک سلول مشکوک به داخل محیط تلقیح می‌شود. لکه‌های سیاه نوار استات سرب به‌عنوان واکنش مثبت قلمداد می‌شود. سویه‌های کنترل هم زمان مورد آزمایش قرار می‌گیرند.
7) حساسیت به سفالوتین و نالیدیکسیک اسید:
حساسیت به سفالوتین (CN) و نالیدیکسیک اسید (NA) با استفاده از صفحاتی که حاوی CN (30 میکروگرم) هستند، مورد آزمایش قرار می‌گیرند. برای آزمایش،کشت‌های 72 ساعته داخل PBS با غلظت 109 باکتری در هر میلی‌لیتر، تعلیق می‌شود.
با استفاده از سوسپانسیون 100 میکرولیتر در محیط پایه خون گسترده می‌شود. صفحات حساس در قسمت بالا قرار داده می‌شوند. این پلیت‌ها در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و در اتمسفر خاص گرم‌خانه گذاری می‌شوند سپس بعد از 48 و72 ساعت بررسی می‌شوند.
یک ناحیه ممانعتی به اندازه حداقل 3 میلی‌متر در اطراف یک صفحه نشان‌دهنده سویه حساس به آنتی‌بیوتیک موردنظر است. همه سویه‌های کمپیلوباکتر فتوس تحت گونه فتوس و بیشتر سویه‌های کمپیلوباکتر فتوس تحت گونه ونرالیس به NA مقاوم و همه کمپیلوباکتر فتوس‌ها به CN حساس هستند.