به گزارش «سرویس دام، طیور و آبزیان» «ماکی دام - پایگاه خبری صنعت دام، طیور و آبزیان»؛ تشخیص جرم بر پایه جداسازی ارگانیسم از بافت (حتی بافت‌هایی که به‌صورت غیر سترون در زمان کالبدگشایی تهیه شده‌اند) یا از مدفوع و سوآب مقعدی میباشد. همچنین می‌توان از نمونه‌های محیطی، غذا و علوفه نیز باکتری را جداسازی نمود.
با استفاده از آزمایش‌های سرم‌شناسی می‌توان آلودگی‌های قبلی یا آلودگی فعلی دام‌ها به سرووار‌های سالمونلا را تشخیص داد. زمانی که اندام‌های تولیدمثلی آلوده می‌شوند و همچنین زمانی که سقط یا آلودگی جنین اتفاق می‌افتد، کشت از محتویات معده جنین، جفت و سوآب واژن الزامی است.
سالمونلا‌ها با استفاده از روش‌های متنوعی جداسازی می‌شوند. این روش‌ها شامل پیش‌غنی‌سازی محیط جهت احیا کردن سالمونلا‌های آسیب دیده، غنی‌سازی محیط با مواد ممانعت‌کننده که باعث سرکوب کردن رشد سایر ارگانیسم‌ها می‌گردد و استفاده از آگار پلیت انتخابی برای تفریق سالمونلا از سایر انتروباکتر‌ها میباشد.
آزمایش‌های بیوشیمیایی، سرم‌شناسی و مولکولی متنوعی برای تهیه کشت خالص وجود دارد، که به منظور تأیید قطعی سویه سالمونلای جدا شده مورد استفاده قرار می‌گیرند. سالمونلا‌ها دارای آنتی‌ژن‌های پیکری (O)، تاژکی (H) و حدت (V) هستند.
این آنتی‌ژن‌ها با استفاده از سرم تایپینگ اختصاصی شناسایی می‌شوند. با رجوع به فرمول آنتی‌ژنیک در جدول کافمن- وایت، می‌توان سرووار‌ها را شناسایی نمود. بسیاری از آزمایشگاه‌ها نمونه‌های جداسازی شده را به آزمایشگاه‌های مرجع ارسال می‌کنند، تا بدین وسیله هویت کامل سرمی تأیید و تیپ فاژ و ژنوتیپ سویه مشخص شود.
نمونه‌گیری‌های متناوب و همینطور نوع نمونه‌هایی که جمع‌آوری می‌شوند تا حد زیادی بستگی دارند به:
• اهداف برنامه آزمایش (از جمله هرگونه الزامات قانونی)
• نشانی‌های بالینی
• سطح تشخیص یا دقتی که در تخمین میزان شیوع به کار رفته است
• هزینه‌ها
• در دسترس بودن منابع نمونه‌گیری و امکانات آزمایشگاهی
• جهت راهنمایی روش‌های نمونه‌گیری برای تولید اولیه و همینطور آماده‌سازی نمونه‌ها در آزمایشگاه، استاندارد ISO جدید تهیه شده است.
تهیه نمونه‌های انفرادی برای آزمایش‌های باکتری‌شناسی در مواردی که در دام نشانه‌های بالینی مشاهده می‌شود و یا جهت مونیتورینگ دام‌ها، باید تا آنجایی که ممکن است به صورت سترون انجام پذیرد.
همچنین لازم است که نمونه‌ها را قبل از هرگونه اقدام درمانی با آنتی‌بیوتیک جمع‌آوری نمود. بهتر است که نمونه‌های بالینی در مرحله حاد بیماری یا بلافاصله پس از مرگ دام تهیه شوند.
مراقبت‌های لازم جهت جلوگیری از آلوده شدن نمونه‌ها در زمان نمونه‌گیری، حمل و نقل و همینطور در آزمایشگاه باید به‌خوبی اعمال شود. نمونه‌های بسته‌بندی شده باید سرد نگهداری شوند و اطلاعات لازم همراه آنها موجود باشد.
در مورد دام‌های کوچک‌تر، درصورت امکان بهتر است تعدادی از دام‌های بیمار یا دام‌هایی که به‌تازگی تلف شده‌اند را به آزمایشگاه ارسال نمود. جداسازی سرووار‌های عادت یافته به میزبان از مدفوع معمولاً کار دشواری است، در این موارد از بافت‌های آلوده کشت تهیه می‌شود.
باید به دام‌هایی که مبتلا به شکل تحت حاد سالمونلوز شده‌اند توجه ویژه‌ای شود، چراکه این دام‌ها باعث دفع سالمونلا به‌طور متناوب و با تعداد کم می‌شوند.
ازجمله مواردی که می‌تواند حساسیت تشخیص را افزایش دهد شامل افزایش اندازه و تعداد نمونه‌ها که باعث تشخیص اختصاصی‌تری می‌گردد، ترکیب کردن نمونه‌های مربوط به چند دام و تکرار نمونه‌گیری‌ها میباشد.
در این شرایط روش‌های باکتری‌شناسی و سرم‌شناسی بیشتر از اینکه موارد انفرادی آلودگی را تشخیص دهد، جهت تشخیص گله‌های آلوده به‌کار گرفته می‌شود.
• کشت
روش‌های متنوعی جهت جداسازی سالمونلا وجود دارد. روش کشت در محیط که بهترین روش در شرایط تشخیصی خاص است، به عوامل متعدی بستگی دارد که از جمله این عوامل می‌توان به سرووار سالمونلا، نوع و منشأ نمونه‌ها، گونه حیوان، تجربه فرد آزمایشگر و در دسترس بودن محیط غنی شده انتخابی و محیط پلیت انتخابی اشاره کرد.
تمامی محیط‌های کشت باید ازلحاظ کیفیت کنترل شده و با یک تلقیح کوچک در حضور ماتریکس نمونه‌های مربوط، باعث رشد ارگانیسم شود.
اگر به‌جای نمونه‌های رایج از سویه‌های مرجع معمول استفاده گردد و روش‌های غیر دقیق مورد استفاده قرار گیرد، ممکن است باعث آلودگی متقاطع نمونه‌ها شود. بنابراین باید از سرووار کمیاب با رشد واضح که بیشترین شباهت را به سویه‌های هدف دارد استفاده شود.
همچنین ممکن است از سویه‌هایی با مقاومت ضدمیکروبی یا نشانگر‌های پروتئینی فلئورسنت سبز استفاده شود. افزایش کیفیت برنامه‌های کاربردی باعث استفاده بیشتر از روش‌های استاندارد بین‌المللی مانند 6579:2002 ISO می‌شود.
حتی اگر برای نمونه‌های مدفوع و نمونه‌های محیطی معتبر نباشد، اما برای مواد غذایی کاربرد دارد. در سال‌های اخیر، یک روش استاندارد برای تشخیص سالمونلا در تولیدات اولیه دام، توسعه یافته و مورد ارزیابی قرار گرفته شده است و یک روش (ISO 6579:2002 Annex D) ISO امروزه مورد استفاده قرار می‌گیرد.
روش استاندارد براساس پیش غنی‌سازی در بافر آب پپتونه، غنی‌سازی در محیط نیمه جامد اصلاح شده راپاپورت - (MSRV) vassiliadis، جداسازی در گزیلوز - لیزین- داکسی کولات و استفاده از یک پلیت محیط انتخابی میباشد.
مشخص شده است که این روش اثر زیادی بر تولیدات غذایی و گوشتی دام‌ها دارد. همچنین این روش آسان تر و ارزان تر از روش کامل ISO است.
الف) محیط پیش غنی شده
تعداد سالمونلا‌ها در دام‌های بدون علامت بالینی، نمونه‌های محیطی، خوراک دام (animal food and feed) معمولاً کم است، بنابراین لازم است که از محیط پیش غنی‌سازی مانند بافر آب پپتونه یا براث پیش غنی‌سازی شده عمومی، جهت کمک به جداسازی جرم استفاده شود. به این وسیله تعداد کم سالمونلا‌ها تکثیر مییابند.
همچنین سالمونلا‌هایی که در اثر انجماد، حرارت، خشک شدن، زیست کش‌ها، اسید‌های ارگانیک، باکتریوسین‌ها و فاژها به‌صورت sub lethaly آسیب دیده‌اند، احیا می‌شوند.
پیش غنی‌سازی بهترین روش برای جداسازی سویه‌های حاد سالمونلا (مانند سویه‌های عادت یافته به میزبان) از مدفوع نیست، چراکه سایر ارگانیسم‌ها به‌صورت رقابتی در طی پیش غنی‌سازی غیر انتخابی، دارای رشد بیش از اندازه هستند.
ب) محیط غنی شده
محیط غنی شده، مایع یا آگار نیمه جامد است و شامل افزودنی‌هایی میباشد که به‌طور انتخابی اجازه رشد سالمونلا را می‌دهد در حالی که از رشد سایر ارگانیسم‌ها جلوگیری می‌کند. با این وجود برخی از این محیط‌های غنی شده برای برخی از سرووار‌های سالمونلا نسبتاً سمی هستند.
ازجمله اینکه سلنیت از رشدS.Choleraesuis ممانعت می‌کند و بریلینت گرین نیز برای بسیاری از سویه‌های S.Dublin سمی میباشد. از افزایش درجه حرارت نیز برای بالا بردن انتخابی بودن محیط غنی شده استفاده می‌شود.
برای مثال تتراتیونات و راپاپورت- Vassiliadis در دمای 43 درجه سانتی‌گراد از رشد سویه‌های حساس به حرارت به‌خصوصS.Dublin ممانعت می‌کند. امروز برای گرم‌خانه گذاری محیط راپاپورت - vassiliadis با پایه براث، دمای 41/5 درجه سانتی‌گراد توصیه می‌شود.
محیط حرکت غنی شده انتخابی برای افزایش حساسیت جداسازی سالمونلا استفاده می‌شود. همچنین محیط نیمه جامد غنی شده مانند MSRV یا محیط تشخیصی نیمه جامد سالمونلا (DIASALM) دارای حساسیت بیشتری می‌باشند.
فرمولاسیون محیط‌ها ممکن است گاهی بین تأمین‌کنندگان یا حتی دسته‌های مختلف متفاوت باشد. همچنین دما، مدت گرم‌خانه گذاری و حجم نمونه‌ای که برای تلقیح به محیط، مورد استفاده قرار می‌گیرد، همگی بر میزان جداسازی جرم مؤثر می‌باشند.
بنابراین چنین متغیر‌هایی همیشه باید مدنظر قرار بگیرند. ازجمله محیط‌های انتخابی غنی‌شده می‌توان سدیم تتراتیونات به‌عنوان براث مولر -کافمن، سلنیت F، سلنیت سیستئین، براث بریلینت گرین، براث راپاپورت vassiliadis- یا محیط نیمه جامد راپاپورت vassiliadis- را نام برد.
گاهی بهتر است بیش از یک براث انتخابی به کار برده شود، یا اینکه با پیش‌غنی‌سازی و غنی‌سازی انتخابی مستقیم (یا پلیت مستقیم) کشت تهیه کرد، که البته در اکثر موارد این اقدامات از نظر هزینه‌های اضافی به‌صرفه نمی‌باشد.
می‌توان از افزودنی‌هایی مانند فریوکسالین E به محیط انتخابی استفاده نمود. این افزودنی باعث افزایش جداسازی سالمونلا از آهن یا نمونه‌های محدود شده مواد غذایی مانند تخم‌مرغ، آب یا خاک می‌گردد.
همچنین افزودن آنتی‌بیوتیک‌هایی مانند نووبیوسین می‌تواند باعث سرکوب شدن رشد اکثر ارگانیسم‌های گرم مثبت یا سایر باکتری‌های گرم منفی مانند پروتئوس شود. افزودن آنتی‌بیوتیک‌های اختصاصی می‌تواند باعث افزایش جداسازی سویه‌هایی از سالمونلا‌ها که مقاوم به ضدمیکروب‌ها هستند، شود.
ج) محیط پلیت انتخابی
این محیط‌ها جامد و آگار انتخابی هستند و باعث رشد باکتری‌ها با درجات مختلف می‌گردد. این محیط‌ها از رشد سایر باکتری‌ها به غیر از سالمونلا‌ها جلوگیری می‌کنند و اطلاعاتی نیز در مورد اختلافات بیوشیمیایی مهم در اختیار قرار می‌دهند.
معمولاً لاکتوز را تخمیر نکرده و هیدروژن سولفید تولید نمی‌کند. نتایج 48-24 ساعت پس از کشت دادن در دمای 37 درجه سانتی‌گراد قرائت می‌شود.
در چنین محیطی کلونی‌های سالمونلا از کلونی‌های متعلق به سایر باکتری‌ها قابل تفریق است، البته گاهی موارد استثنا نیز در مورد باکتری‌های پروتئوس، پزودوموناس، سیتروباکتر و‌هافنیا وجود دارد که در این صورت تفریق کلونی سالمونلا از این باکتری‌ها امکان‌پذیر نیست.
گاهی ممکن است سالمونلا‌هایی که لاکتوز را تخمیر کرده و تولید H2S می‌کنند نیز جداسازی شوند. هنگامی که از محیط نیمه‌جامد انتخابی استفاده می‌شود، شناسایی چنین سویه‌های غیرمعمولی به‌خوبی صورت می‌گیرد.
در این موارد می‌توان از محیط DIASALM استفاده نمود که جهت تأیید تشخیص، آزمون آگلوتیناسیون اسلاید به‌کار گرفته می‌شود. در این آزمون از آنتی‌ژن‌های چندظرفیتی H و O یا آنتی‌سرم‌های اختصاصی که کلونی از ناحیه رشد در پلیت به محیط مایع منتقل می‌شود.
برای این منظور از پلیت‌هایی مانند آگار دس اکسیلات سیترات (DCA) یا آگار بیسموت سولفیت (BS) استفاده می‌شود. اگرچه در این محیط‌ها موارد مثبت کاذب افزایش مییابند.
سالمونلا آبورتوس اویس یک سرووار کند رشد است و برای جداسازی این سرووار، معمولاً پلیت‌ها را تا 72 ساعت گرم‌خانه گذاری کرده و از محیط بلاد آگار غیر انتخابی استفاده می‌شود.
ازجمله محیط‌های انتخابی شامل آگار بریلینت گرین، آگار گزیلوز- لیزین - دس اکسیلات، آگار داکسی کولات/سیترات و آگار بیسموت سولفیت میباشد، اگرچه بسیاری از آنها ممکن است در literatureو محیط کاتالوگ یافت شوند.
امروزه طیف وسیعی از محیط‌های آگار کروموژنیک مانند آگار ASAP و SMID ،Rambach موجود میباشد. بسیاری از این محیط‌ها می‌توانند کلونی‌های مشکوک را از یکدیگر تفریق کنند اما باید ماتریکس‌های نمونه، سیستم‌های کشت و طیف سرووار‌های مورد استفاده معتبر باشد چراکه حساسیت پایینی دارد.