به گزارش «سرویس دام، طیور و آبزیان» «ماکی دام - پایگاه خبری صنعت دام، طیور و آبزیان»؛ بررسی ویژگی‌های ظاهری جرم می‌تواند شواهدی را مبنی بر وجود بروسلا در اختیار ما قرار دهد.
برای این منظور از رنگ‌آمیزی اسیدفاست اصلاح شده و بررسی ساختار بروسلا در نمونه‌های تهیه شده از جنین سقط شده یا ترشحات واژن (بخصوص زمانی که همراه با آزمایش‌های سرم‌شناسی باشد) استفاده می‌شود. PCR نیز روشی دیگر برای تشخیص باکتری است.
لازم است گونه‌های بروسلا را جداسازی کنیم. برای این کار، از نمونه‌های تهیه شده شامل ترشحات رحمی، جنین‌های سقط شده، ترشحات پستان و همینطور بافت‌هایی چون گره‌های لمفاوی و اندام‌های تناسلی جنس نر و ماده، در محیط‌های ساده یا انتخابی کشت می‌دهیم.
گونه‌ها و بیووار‌های بروسلا توسط روش‌های لیز فاژ، کشت، سرم‌شناسی و بیوشیمیایی شناسایی می‌شوند. PCR در عین اینکه یک روش مکمل است، می‌تواند بیوتیپ باکتری را بر اساس توالی‌های ژنومی اختصاصی شناسایی کند.
الف) روش‌های رنگ‌آمیزی:
بروسلا‌ها اجرام کوکوباسیل یا میله‌ای کوتاه هستند و اندازه آن‌ها 1/5-μm 0/6 طول و μm 0/7-0/5 عرض می‌باشد. این باکتری‌ها معمولاً به‌صورت منفرد مشاهده می‌شوند اما گاهی نیز به‌صورت دوتایی یا در گروه‌های کوچک قرار می‌گیرند.
ساختار بروسلا‌ها معمولاً ثابت است، به‌جز در کشت‌های قدیمی که به‌صورت اجرام چندشکلی مشاهده می‌گردند. بروسلا غیرمتحرک و فاقد هاگ می‌باشد. همچنین این باکتری فاقد تاژک، مژه یا کپسول حقیقی است. بروسلا گرم منفی بوده و با رنگ‌آمیزی دو قطبی رنگ نمی‌شود.
این اجرام به‌طور حقیقی اسید فاست نمی‌باشند، اما نسبت به رنگ‌زدایی توسط اسید‌های ضعیف مقاوم هستند. بنابراین با روش اصلاح شده استامپ زیل نیلسون، به رنگ قرمز مشاهده می‌شوند. این یک روش معمول برای بررسی گسترش‌های تهیه شده از اندام‌ها یا مایعات بیولوژیک است که قبلاً با استفاده از حرارت یا اتانول ثابت شده‌اند.
در این روش بروسلا‌ها به‌صورت اجرام قرمز در زمینه‌ای آبی مشاهده می‌شوند. می‌توان از روش فلوکروم یا پراکسیداز نشاندار که بر اساس آنتی بادی متصل شده (کونژوگه) می‌باشد نیز، استفاده نمود.
حضور ارگانیسم‌های داخل سلولی و اسید فاست ضعیف، با ویژگی‌های ساختاری بروسلا یا ارگانیسم‌هایی که با روش اختصاصی ایمنی رنگ‌آمیزی شده‌اند، احتمالاً نشان‌دهنده بروسلوز است.
با این وجود، این روش در مورد نمونه‌های شیر و محصولات لبنی که حاوی تعداد کم‌تری بروسلا است، حساسیت پایینی دارد. همچنین تفسیر نتایج به‌دلیل حضور گلبول‌های چربی دشوار می‌باشد.
در تفسیر نتایج مثبت، باید دقت لازم را به‌عمل آورد، زیرا سایر ارگانیسم‌هایی که باعث سقط می‌شوند مانند کلامیدوفیلا آبورتوس یا کوکسیلا بورنتی، مشابه بروسلا بوده و تفریق آن‌ها مشکل می‌باشد.
نتایج حاصل چه مثبت باشند و چه منفی باید با کشت تأیید گردند. روش پروب‌های DNA یا PCR برای تشخیص جرم در نمونه‌های بیولوژیک مختلف نیز، قابل استفاده می‌باشد.
ب) کشت
1) محیط کشت پایه:
جداسازی مستقیم و کشت بروسلا که به‌طور معمول در محیط جامد صورت می‌گیرد، بهترین روش مورد استفاده است، چراکه کولونی‌ها را قادر به جداسازی می‌کند و درنتیجه اجرام به خوبی قابل شناسایی می‌شوند.
این محیط تشکیل موتانت‌های غیرصاف را محدود کرده و از آلودگی بیش از اندازه جلوگیری می‌کند. به هرحال گاهی ممکن است به منظور غنی‌سازی و یا برای نمونه‌های حجمی، استفاده از محیط کشت مایع توصیه گردد.
طیف وسیعی از محیط‌های پایه دهیدراته به‌صورت تجاری در دسترس می‌باشد، مانند محیط پایه بروسلا، آگار تریپتوز (یا تریپتیکاز) – سویا (TSA).
برای رشد سویه‌هایی چون بروسلا آبورتوس بیووار 2، افزودن 2-5% سرم گاو یا اسب ضروری است، به طوری‌که بسیاری از آزمایشگاه‌ها سرم را به محیط کشت پایه اضافه می‌کنند.
از جمله اضافه کردن به محیط پایه بلاد آگار (اکسوئید) یا آگار کلومبیا (Biomérieux) که نتایج بسیار خوبی را در اختیار قرار می‌دهند.
می‌توان از سایر محیط‌های مناسب مانند آگار سرم دکستروز (SDA) یا آگار دکستروز گلیسرول نیز استفاده نمود. SDA محیط مناسب‌تری جهت بررسی ساختار کلونی‌ها می‌باشد.
استفاده از محیط دو فازی غیرانتخابی به نام محیط Castañeda᾿s برای جداسازی بروسلا از خون و سایر مایعات بدن مانند شیر توصیه می‌شود. علت استفاده از محیط Castañeda᾿s این است که بروسلا تمایل دارد که در محیط براث جدا شود و این امر با تعیین بیوتیپ‌ها با روش‌های معمول باکتری‌شناسی تداخل می‌نماید.
2) محیط انتخابی:
تمام محیط‌های پایه‌ای که در مطالب فوق به آن‌ها اشاره شد، می‌توانند برای تهیه محیط انتخابی مورد استفاده قرار گیرند. لازم است آنتی‌بیوتیک‌های مناسب جهت جلوگیری از رشد سایر ارگانیسم‌ها اضافه شوند.
بیشترین محیط انتخابی مورد استفاده، محیط Farrell᾿s می‌باشد که با اضافه کردن 6 آنتی‌بیوتیک به محیط کشت پایه به‌دست می‌آید. مقادیر زیر به یک لیتر آب اضافه می‌شوند:
پلی میکسین B سولفات (5000 واحد = 5 میلی‌گرم)، باسیتراسین (25،000 واحد = 25 میلی‌گرم)، ناتامایسین (50 میلی‌گرم)، نالیدیکسیک اسید (5 میلی‌گرم)، نیستاتین (100،000 واحد)، ونکومایسین (20 میلی‌گرم).
مکمل آنتی‌بیوتیک با یخ خشک به‌صورت تجاری موجود می‌باشد (اکسوئید). به هرحال نالیدیکسیک اسید و باسیتراسین در غلظت‌هایی که در محیط Farrell᾿s استفاده می‌شوند اثرات مهاری بر روی برخی از سویه‌های بروسلا آبورتوس و بروسلا ملی تنسیس دارند.
بنابراین، حساسیت کشت را با استفاده همزمان از Farrell᾿s و محیط Thayer-Martin اصلاح شده، به میزان قابل توجهی افزایش می‌دهند.
به‌طور خلاصه، محیط Thayer-Martin اصلاح شده توسط محیط پایه GC تهیه شده (gr/lit 38 در آزمایشگاه Biolife، میلان، ایتالیا) و با هموگلوبین (gr/lit 10، Difco)، کولیستین متان سولفونات (mg/lit 7/5) ونکومایسین (mg/lit 3)، نیتروفورانتیون (mg/lit 10)، نیتاتین (100،000 واحد بین‌المللی در لیتر = mg 17/5) و آمفوتریسین B (mg/li 2/5) غنی می‌شود.
برخلاف بیووار‌های متعدد بروسلا آبورتوس، برای رشد بروسلا ملی تنسیس احتیاجی به اتمسفر کربن دی اکسید 10-5، نمی‌باشد.
از آنجا که امکان دارد تعداد بروسلا‌ها در نمونه‌های شیر، آغوز و برخی نمونه‌های بافتی کمتر از نمونه‌های تهیه شده از مواد سقطی باشد، توصیه می‌شود که محیط‌های کشت غنی شوند.
درمورد نمونه‌های شیر، استفاده از سانتریفوژ و کشت از خامه و پلت نتایج بهتری را در اختیار ما قرار می‌دهد، اما در این موارد برای جلوگیری از آلودگی آئروسل‌ها رعایت اصول ایمنی ضروری می‌باشد.
غنی کردن می‌تواند در محیط مایعی صورت گیرد که حاوی براث سرم دکستروز، براث تریپتوز (یا تریپتیکاز) – سویا (TSA) یا براث بروسلا (که با مخلوط آنتی‌بیوتیکی شامل حداقل آمفوتریسین μg/ml B 1 و ونکومایسین μg/ml1 20، غنی شده است) باشد.
انکوباسیون (گرم خانه گذاری) محیط غنی شده باید به همراه کشت ثانویه ضعیف در محیط انتخابی جامد، در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و هوای غنی شده با کربن دی‌اکسید 10-5% به مدت 6 هفته صورت گیرد.
ترجیحاً روش دو فازی استفاده از محیط انتخابی جامد و مایع در بطری‌های مشابه (روش Castañeda᾿s) برای به حداقل رساندن کشت ثانویه می‌تواند مفید باشد. گاهی اوقات برای جداسازی بروسلا از شیر، استفاده از یک محیط انتخابی دو فازی، با ترکیب محیط Castañeda᾿s پایه به همراه افزودن آنتی‌بیوتیک‌های زیر به فاز مایع توصیه می‌شود. (مقادیر زیر در یک لیتر محیط می‌باشند):
پلی میکسین B (سولفات) ( 6000 واحد = 6 میلی‌گرم)، باسیتراسین (25000 واحد = 25 میلی‌گرم)، ناتامایسین (50 میلی‌گرم)، نالیدیکسیک اسید (5 میلی‌گرم)، آمفوتریسین B (1 میلی‌گرم)، ونکومایسین (20 میلی‌گرم)، D سیکلوسرین (100 میلی‌گرم).
تمام محیط‌های کشت باید ازلحاظ کیفیت کنترل شوند و باید رشد سویه‌های بروسلا را از یک تلقیح کوچک تا سویه‌های سخت رشد مانند بیووار 2 بروسلا آبورتوس را تضمین کنند. در محیط کشت جامد مناسب، کلونی‌های بروسلا بعد از 3-2 روز گرم خانه گذاری قابل مشاهده هستند.
بعد از 4 روز گرم خانه گذاری، کلونی‌های بروسلا به‌صورت گرد و با قطر 2-1 میلی‌متر با حاشیه صاف مشاهده می‌شوند. این کلونی‌ها شفاف هستند و هنگامی‌که آن‌ها را در مقابل نور قرار می‌دهیم به رنگ عسلی روشن مشاهده می‌گردند.
همچنین وقتی کلونی‌ها را از بالا نگاه می‌کنیم، آن‌ها را به‌صورت محدب و به رنگ سفید مرواریدی می‌بینیم. به مرور زمان کلونی‌ها بزرگ‌تر شده و به‌تدریج تیره‌تر می‌گردند.
کشت‌های صاف بروسلا تمایل دارند که در طی رشد خود، به‌ویژه در کشت‌های ثانویه دستخوش تغییر شوند، همچنین تمایل دارند به شکل خشن تبدیل شوند. بنابراین، شفافیت کلونی‌ها کمتر می‌شود.
کلونی‌ها به شکل گرانولر هستند، کلونی‌ها مات بوده و به رنگ سفید مات تا قهوه‌ای در نور منعکس شده یا نور عبوری، مشاهده می‌شوند. آزمون بررسی جداسازی باکتری، با استفاده از رنگ‌آمیزی کریستال ویوله به‌راحتی قابل انجام است.
کلونی‌های خشن به رنگ قرمز و کلونی‌های صاف یا رنگ را جذب نمی‌کنند و یا اینکه به رنگ زرد روشن مشاهده می‌شوند.
اگر کلونی‌ها صاف هستند، باید آن‌ها را در مجاورت آنتی‌سرم بروسلا آبورتوس با پرگنه‌های صاف و یا ترجیحاً در مجاورت سرم‌های تک اختصاصی آنتی M و Aقرار داد. در مواردی که کلونی‌ها صاف نیستند، برای بررسی باکتری‌های جدا شده باید آنتی‌سرم را درمجاورت آنتی ژن خشن بروسلا قرار داد.
معمولاً تغییرات ساختاری کلونی همراه است با تغییر در حدت، ویژگی‌های سرم‌شناسی و یا حساسیت فاژ. ساختار شاخص (تیپیک) کلونی و نتیجه آگلوتیناسیون مثبت با آنتی‌سرم بروسلا، احتمالاً نشان‌دهنده جداسازی بروسلا است.
3) جمع‌آوری و کشت نمونه‌ها جهت تشخیص بروسلا
تشخیص باکتری
قاعده کلی آزمایش
در این روش با رنگ‌آمیزی اختصاصی، حضور باکتری در گسترش یا مقاطع بافتی بررسی می‌شود. روش رنگ‌آمیزی استامپ، شیوه‌‍ای قدیمی در تشخیص بروسلا می‌باشد.
مواد و معرف‌ها
- ظرف رنگ‌آمیزی
- میکروسکوپ نوری
- رنگ زیل فوشین (محلول ذخیره: 1 گرم از فوشین پایه را در داخل 10 میلی‌لیتر الکل خالص حل کنید، سپس 90 میلی‌لیتر فنول 5% به آن اضافه کنید)
- 0/5 درصد استیک اسید
- 1% متیلن بلو
روش کار
1- یک گسترش یا قسمتی از نمونه را برداشت و آن را با شعله ثابت کنید.
2- با زیل فوشین (که به نسبت 1 به 10 رقیق شده است) به مدت 10 دقیقه رنگ‌آمیزی کنید.
3- سپس آن را به خوبی با آب بشویید.
4- با استفاده از استیک اسید 0/5درصد به مدت 30 ثانیه رنگ‌بری کنید.
5- سپس آن را به‌خوبی با آب بشویید.
6- دومین رنگ‌آمیزی را با استفاده از متیلن بلو 1% به مدت 20 ثانیه انجام دهید.
7- آن را با آب به خوبی بشویید.
قرائت و تفسیر نتایج
بروسلا‌ها به‌صورت اجسام قرمز در زمینه‌ای آبی به صورت منفرد یا چندتایی (زنجیری) و معمولاً داخل سلولی مشاهده می‌شوند. نتایج مثبت لزوماً نشان‌دهنده آلودگی نیست.
گاهی به دلیل فقدان ارگانیسم یا بیش از حد بودن آن در نمونه، نتایج به دست آمده همراه با خطا است. بنابراین نتیجه این آزمایش چه مثبت باشد و چه منفی باید با کشت دادن تأیید شود.