به گزارش «سرویس آموزشی» «ماکی دام - پایگاه خبری صنعت دام، طیور و آبزیان»؛ تکنیک PCR یا واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (Polymerase Chain Reaction)، تکنیکی است که با استفاده از آن می‌توان در مدت زمان کوتاهی قطعه خاصی از مولکول DNA را در شرایط آزمایشگاهی میلیون‌ها بار تکثیر نمود. این قطعه DNA ممکن است یک ژن، بخشی از یک کروموزوم یا بخش‌هایی از ژنوم یک موجود باشد. البته در تکثیر DNA با روش PCR محدودیت‌هایی نیز وجود دارد که مهم‌ترین آن‌ها اندازه قطعات قابل تکثیر می‌باشد به طوری که حداکثر اندازه قطعه‌هایی که با روش PCR معمولی تکثیر می‌گردد، ۵هزار نوکلئوتید (Kb ۵) و در روش‌های بهینه شده تا ۲۰ هزار نوکلئوتید (Kb ۲۰) می‌باشد.
اساس این روش بسیار ساده بوده و مانند واکنش همانندسازی DNA در موجودات زنده توسط آنزیم DNA پلیمراز صورت می‌گیرد. در موجودات زنده، مجموعه‌ای از چند پروتئین و آنزیم در فرآیند همانندسازی DNA نقش دارند در حالی که در واکنش PCR تنها نوع خاصی آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت به نام Taq Polymerase به همراه بافر، کلرید منیزیم و نوکلئوتیدها جهت تکثیر قطعات DNA استفاده می‌شود.
واکنش PCR به طور روزمره در اکثر آزمایشگاه‌های تشخیصی و تحقیقاتی استفاده می‌شود و در موارد بسیاری مثل شناسایی و جداسازی ژن‌ها، کلونینگ، طبقه‌بندی و شناسایی موجودات زنده، تشخیص بیماری‌های ژنتیکی و حتی پرونده‌های جنایی و تعیین هویت کاربرد دارد. در حال حاضر و نزدیک به ۳۰ سال پس از کشف PCR، تحقیقات ژنتیک مولکولی بدون استفاده از این تکنیک قابل تصور نیست.
سازوکار (برنامه) واکنش PCR
اساس واکنش PCR جهت تکثیر توالی DNA دو رشته‌ای، تغییرات دمایی می‌باشد. در ابتدا پیوندهای هیدروژنی دو رشته توالی DNA با حرارت (۹۴-۹۵ درجه سلسیوس) شکسته و دو رشته از یکدیگر جدا می‌شوند. سپس دمای واکنش پایین آورده می‌شود (معمولاً ۵۰ تا ۶۰ درجه سلسیوس). در این مرحله، دو قطعه کوتاه DNA تک رشته‌ای (معمولاً بین ۱۸ تا ۳۰ نوکلئوتید) که دقیقاً مشابه دو طرف قطعه DNA مورد نظر برای تکثیر طراحی و ساخته شده‌اند (با نام پرایمر یا آغازگر)، به توالی‌های مکمل خود در دو رشته باز شده DNA متصل می‌گردند. این دو قطعه انتهای ۳’ آزاد جهت فعالیت آنزیم DNA پلیمراز را فراهم می‌نماید، کاری که در همانندسازی در موجودات زنده توسط آنزیم پریماز و توالی اولیه ساخته شده توسط آن انجام می‌گیرد. در مرحله بعد، دمای واکنش تا ۷۲ درجه سلسیوس (دمای مناسب آنزیم Taq Polymerase) افزایش یافته و عمل تکثیر قطعه DNA مورد نظر بین دو پرایمر با استفاده از نوکلئوتیدهای موجود، توسط آنزیم Taq Polymerase مقاوم به حرارت انجام می‌پذیرد.
•مرحله اول: واسرشت‌سازی (Denatiration) به مدت ۳۰ تا ۶۰ ثانیه: جدا شدن دو رشته DNA
•مرحله دوم: اتصال (Annealing) به مدت ۳۰ تا ۶۰ ثانیه: عمل انجام شده در این مرحله عبارتند از اتصال پرایمرها به نواحی مکمل روی DNA و تعیین محدوده تکثیر قطعه DNA
•مرحله سوم: گسترش (Extension یا Elongation) به ازای هر ۱۰۰۰ نوکلئوتید طول قطعه ۶۰ ثانیه: عمل انجام شده در این مرحله: تکثیر قطعه DNA مورد نظر
این ۳ مرحله بین ۲۵ تا ۴۰ بار تکرار می‌شود که به آن چرخه‌های PCR می‌گویند.
نمونه DNA (الگو)
تکثیر از روی نمونه DNA انجام می‌شود. این نمونه می‌تواند، قطعه‌ای DNA، محصول استخراج DNA ژنومی، DNA پلاسمیدی یا حتی محصول PCR دیگری باشد. معمولاً حدود یک نانوگرم از DNA پلاسمیدی یا فاژی یا یک میکروگرم از DNA ژنومی برای یک واکنش PCR کافی است. بیش از این مقدار، باعث تولید محصولات غیر اختصاصی (قطعات DNA دیگری غیر از قطعه مورد نظر) شده و مقدار کم نمونه DNA نیز باعث کاهش دقت واکنش PCR یا عدم تکثیر قطعه مورد نظر می‌گردد. کیفیت نمونه DNA نیز مهم است به طوری که باقی ماندن ترکیبات مورد استفاده در مرحله استخراج DNA مثل فنل و EDTA، باعث کاهش فعالیت آنزیم Taq Polymerase و عدم حصول نتیجه مورد نظر می‌گردد. همچنین آلوده شدن واکنش PCR با مقادیر بسیار اندک DNA از هر منبع دیگری، به دلیل حساسیت فوق‌العاده این تکنیک، ممکن است به تولید قطعات غیرقابل انتظار بیانجامد.
بیشتر بدانیم:
توکسوپلاسما گوندئی در گربه با سویه Rh
بیان mRNA گیرنده عملکردی لپتین در کبد گوسفند
بررسی الگوی مقاوت داروئی کلستریدیوم پرفرانژنس‌های جداسازی شده از طیورگوشتی
مطالعه مقاومت دارویی سالمونلاهای جداسازی شده ازتخم‌مرغ‌های بومی‌شهرستان فسا
آنزیم Taq Polymerase
این آنزیم برای تکثیر قطعات کمتر از سه هزار جفت باز توصیه شده و پر مصرف‌ترین آنزیم مورد استفاده در PCR می‌باشد. به طور معمول حدود یک واحد از این آنزیم در ۵۰ میکرو لیتر از واکنش PCR استفاده می‌شود. اگر نمونه DNA حاوی مواد ممانعت‌کننده PCR باشد، می‌توان این مقدار را دو تا سه برابر افزایش داد ولی مقادیر بالاتر آنزیم باعث تولید محصولات غیر اختصاصی می‌گردد. گرچه دمای مناسب برای این آنزیم ۷۲ درجه سلسیوس می‌باشد ولی چون این آنزیم در دمای معمولی نیز قادر به تکثیر می‌باشد برای جلوگیری از اتصال قطعات پرایمر به نقاط دیگری روی توالی نمونه DNA و امکان تولید قطعات غیراختصاصی، توصیه می‌شود که تمامی مراحل آماده سازی واکنش PCR بر روی یخ صورت گیرد.
نوکلئوتیدها
چهار نوکلئوتید تشکیل‌دهنده قطعه DNA از اجزا واکنش PCR می‌باشند که به عنوان واحد‌های ساختمانی مورد نیاز در ساخت قطعه DNA استفاده می‌شوند. غلظت مورد نیاز از هریک از نوکلئوتیدها برای واکنش PCR یکسان و برابر ۲۰۰ نانو مولار می‌باشد. برای این منظور از مخلوط‌های آماده واجد هر چهار نوکلئوتید که با غلظت‌های مختلف مثل ۲، ۱۰ و ۲۵ میلی‌مولار موجود است، استفاده می‌شود. به طور مثال، در یک واکنش ۵۰ میکرولیتری PCR باید ۵ میکرولیتر از مخلوط دو میلی‌مولار نوکلئوتیدها برای دستیابی به مقدار مورد نیاز در واکنش استفاده کرد.
بافر
مهم‌ترین نقش بافر PCR تنظیم pH مناسب واکنش PCR و آنزیم Taq Polymerase می‌باشد.
یون منیزیم
یون منیزیم یکی از اساسی‌ترین اجزا واکنش PCR می‌باشد. انواع مختلف آنزیم DNA Polymerase برای فعالیت خود به این یون نیاز دارند و این یون برای اتصال پرایمر و قطعه DNA لازم است. برای تکثیر با Taq Polymerase این یون عمدتاً به صورت ترکیب کلرید منیزیم در واکنش PCR استفاده می‌شود. این ترکیب گاهی در همان بافر PCR قرار داده می‌شود ولی از آنجا که برای برخی واکنش‌های PCR لازم است که غلظت این یون تغییر نماید، این ترکیب به طور جداگانه تهیه و به واکنش PCR افزوده می‌شود.
غلظت بهینه یون منیزیم در واکنش PCR یک تا چهار میلی‌مولار است. غلظت بالاتر از این مقدار باعث تکثیر قطعاتی غیر از قطعه مورد نظر (قطعات غیراختصاصی) شده و غلظت پایین این یون نیز ممکن است به کاهش کارایی واکنش و میزان تولید قطعه مورد نظر منجر شود.
پرایمرها
غلظت بهینه پرایمرها برای واکنش PCR از ۱۰۰ نانو مولار تا یک میکرو مولار متغییر است. غلظت بیش از این، منجر به تولید قطعات غیر اختصاصی می‌شود. طراحی پرایمر نیازمند دقت فراوانی است. دمای مرحله اتصال در برنامه PCR به توالی پرایمرها ارتباط دارد.
وسایل مورد نیاز برای واکنش PCR
حداقل وسایل مورد نیاز برای انجام واکنش PCR، دستگاه ترموسایکلر (ایجادکننده چرخه‌های دمایی)، میکروپیپت، ظرف یخ و وسایل یکبار مصرفی مانند تیپ (جز پلاستیکی که برای کشیدن محلول به میکروپیپت متصل می‌شود) و ویال (لوله‌های درب‌دار کوچک، در دو اندازه بر اساس گنجایش آن‌ها یعنی ۲۰۰ و ۵۰۰ میکرولیتر، که واکنش PCR در آن‌ها انجام می‌شود) و ظروف نگهداری آن‌ها می‌باشد.
وسایل
دستگاه ترموسایکلر برای ایجاد دماهای مختلف در مدت زمان مورد نظر، قابل برنامه‌ریزی می‌باشد.
میکروپیپت برای برداشتن مقادیر اندک مورد نیاز برای واکنش PCR در مقیاس میکرولیتر استفاده می‌شود.
منبع: سایت vetmd